Poznate su genomske sekvence većine virusa.Probe nukleinske kiseline koje su kratki segmenti DNA dizajnirani za hibridizaciju s komplementarnim segmentima virusne DNA ili RNA.Lančana reakcija polimerazom (PCR) je učinkovitija tehnika za otkrivanje virusa.Nedavno su razvijene visokoučinkovite dijagnostičke metode.
A. Tehnika hibridizacije nukleinskih kiselina
Hibridizacija nukleinske kiseline, koja uglavnom uključuje Southern blotting (Southern) i Northern blotting (Northern), je nova tehnika koja se brzo razvija u polju dijagnostike virusa.Obrazloženje testa hibridizacije je korištenje kratkih segmenata DNA (nazvanih "sonda") dizajniranih za hibridizaciju s komplementarnim segmentima virusne DNA ili RNA.Zagrijavanjem ili alkalnim tretmanom, dvolančana ciljna DNA ili RNA razdvajaju se u jednostruke niti i zatim imobiliziraju na čvrstom nosaču.Nakon toga, sonda se dodaje i hibridizira s ciljnom DNA ili RNA.Budući da je sonda obilježena izotopom ili neradioaktivnim nuklidom, ciljna DNA ili RNA mogu se otkriti autoradiografijom ili sustavom biotin-avidin.Budući da je većina virusnih genoma klonirana i sekvencirana, oni se mogu detektirati pomoću sekvenci specifičnih za virus kao sondi u uzorku.Trenutno metode hibridizacije uključuju: dot blot, in situ hibridizaciju u stanicama, DNA blotting (DNA) (Southern blot) i RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR tehnologija
Posljednjih godina razvijen je niz in vitro tehnika amplifikacije nukleinske kiseline na temelju PCR-a za testiranje neosjetljivih ili nekultiviranih virusa.PCR je metoda kojom se može sintetizirati specifična DNA sekvenca in vitro reakcijom polimeraze.Proces PCR uključuje toplinski ciklus od tri koraka: denaturacija, žarenje i ekstenzija. Na visokoj temperaturi (93 ℃ ~ 95 ℃), dvolančana DNA se odvaja u dva jednostruka DNA lanca;tada se na niskoj temperaturi (37℃~60℃), dva sintetizirana nukleotidna početnica spajaju s komplementarnim segmentima DNA;dok na odgovarajućoj temperaturi za enzim Taq (72 ℃), sinteza novih lanaca DNA počinje od 3' kraja početnice koristeći komplementarnu DNA kao predloške i pojedinačne nukleotide kao materijale.Dakle, nakon svakog ciklusa, jedan lanac DNK može se umnožiti u dva lanca.Ponavljanjem ovog procesa, svaki DNA lanac sintetiziran u jednom ciklusu može se koristiti kao predložak u sljedećem ciklusu, a broj DNA lanaca se udvostručuje u svakom ciklusu, što znači da se proizvodnja PCR-a pojačava brzinom od 2n log.Nakon 25 do 30 ciklusa, proizvodnja PCR-a identificira se elektroforezom, a specifični DNA proizvodi mogu se promatrati pod UV svjetlom (254 nm).Zbog svoje prednosti specifičnosti, osjetljivosti i praktičnosti, PCR je prihvaćen u kliničkoj dijagnostici mnogih virusnih infekcija kao što su HCV, HIV, CMV i HPV.Budući da je PCR vrlo osjetljiv，može otkriti DNK virusa na razini fg, operaciju treba provesti vrlo pažljivo kako bi se izbjegle lažne pozitivne reakcije.Osim toga, pozitivan rezultat testa nukleinske kiseline ne znači da u uzorku postoji živi zarazni virus.
Širokom primjenom PCR tehnike razvijaju se nove tehnike i metode temeljene na PCR tehnici za različite svrhe ispitivanja.Na primjer, kvantitativni PCR u stvarnom vremenu može otkriti količinu virusa;in situ PCR se koristi za identifikaciju virusne infekcije u tkivu ili stanicama;Ugniježđeni PCR može povećati specifičnost PCR-a.Među njima, kvantitativni PCR u stvarnom vremenu razvijen je brže.Mnoge nove tehnike, poput TaqMan hidrolizne sonde, hibridizacijske sonde i molekularne beacon probe, kombinirane su u kvantitativnu PCR tehniku u stvarnom vremenu, koja se široko koristi u kliničkim istraživanjima.Osim točne identifikacije količine virusa u tjelesnim tekućinama pacijenata, ova se metoda također može koristiti za otkrivanje mutanta otpornih na lijekove.Stoga se kvantitativni PCR u stvarnom vremenu uglavnom primjenjuje u procjeni ljekovitog učinka i nadzoru tolerancije na lijekove.
C. Visokopropusna detekcija virusnih nukleinskih kiselina
Kako bi se zadovoljile potrebe za brzom dijagnozom novih pojavnih zaraznih bolesti, uspostavljene su različite metode detekcije visoke propusnosti, poput DNK čipova (DNK).Za DNK čipove, specifične sonde se sintetiziraju i pričvršćuju na male silikonske čipove u vrlo visokoj gustoći kako bi se formirala mikronizova DNK sonde (DNK) koja se može hibridizirati s uzorkom.Signal hibridizacije može se prikazati konfokalnim mikroskopom ili laserskim skenerom i dalje obraditi računalom te se može dobiti ogroman skup podataka koji se odnosi na različite gene.Postoje dvije vrste DNK čipova."Čip za sintezu" je sljedeći: specifični oligonukleotidi se sintetiziraju izravno na čipovima.Drugi je DNK skup čip.Klonirani geni ili PCR proizvodi uredno su otisnuti na stakalcu.Prednost tehnologije DNK čipa je istovremeno otkrivanje ogromne količine DNK sekvenci.Najnovija verzija čipa za otkrivanje patogena može identificirati preko 1700 ljudskih virusa odjednom.Tehnologija DNA čipova riješila je probleme tradicionalnih metoda hibridizacije nukleinskih kiselina i ima vrlo široku primjenu u dijagnostici virusa i epidemiološkim studijama.
Vrijeme objave: 23. prosinca 2020